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Sources de résistances aux maladies cryptogamiques et gènes associés

Ces recherches visent à identifier et à caractériser des facteurs génétiques responsables de la résistance à trois maladies de la vigne, le mildiou (Plasmopara viticola), l'oïdium (Erisyphe necator) et le black-rot (Guignardia bidwellii) qui existent dans les ressources génétiques disponibles. Dans un premier temps, ces ressources sont évaluées pour leur résistance à ces pathogènes. L'évaluation du niveau de résistance utilise la plateforme de phénotypage haut débit mise en place à cette fin. Par la suite, des populations de descendants issues de croisements de parents résistants sont créées. Leur patrimoine génétique est déterminé à l'aide de marqueurs moléculaires et en parallèle, leur niveau de résistance aux maladies est évalué en conditions contrôlées. La confrontation des deux jeux de données permet d'identifier les zones du génome (QTLs) impliquées dans la variabilité génétique de la résistance.

1. Identification de gènes Avr et recherche de résistances durables au mildiou de la vigne à l’aide des effecteurs de type RXLR de Plasmopara viticola.

Rational
La plupart de gènes de résistance au mildiou de la vigne identifiés sont cartographiés dans des régions riches en gènes du type NBS-LRR (R). Les gènes R reconnaissent les produits de gènes des pathogènes nommés gènes d’avirulence (Avr) et activent des réactions de défense que limitent le développement du pathogène. Chez les oomycètes, le gènes d’avirulence connus codent pour des protéines avec un peptide signal et un motif RXLR, et ils ont la caractéristique d’activer une réponse d’hypersensibilité (mort cellulaire) quand ils sont exprimes artificiellement en présence du gène R correspondant.
On peut donc envisager une stratégie d’identification de gènes Avr chez P. viticola par criblage de ressources génomiques et expression transitoire de gènes candidats sur des plantes résistantes.

Création de ressources génomiques et identification d’effecteurs de type RXLR
Suite à la validation des spores germées in vitro comme matériel de départ pour la recherche d’effecteurs, nous nous sommes impliqués dans un projet de séquençage à haut débit d’ADNc de P. viticola et de P. halstedii (mildiou du tournesol) mené en collaboration avec des collègues du Laboratoire des Interactions Plantes-Microrganismes (LIPM) de Toulouse et de l’UMR SAVE de Bordeaux. Nous avons séquencé de l’ADNc issu de spores germées in vitro et de tissu infecté en phase invasive de l’infection. Un portail comportant des séquences des deux Plasmopara a été créé par nos collègues bio-informaticiens de Toulouse et mis a disposition de la communauté scientifique (https://www.heliagene.org/PlasmoparaSpecies). L’analyse des séquences a conduit à l’identification de 45 effecteurs candidats de type RXLR, et la comparaison entre les deux Plasmopara et avec d’autres oomycètes a permis d’identifier des effecteurs conservés entre les différentes espèces et donc potentiellement importants pour la biologie du pathogène.
En parallèle, nous avons participé à un effort, piloté par l’UMR SAVE, pour obtenir un assemblage de la séquence du génome de P. viticola.

Mestre P, Piron MC, Merdinoglu D (2012) Identification of effector genes from the phytopathogenic Oomycete Plasmopara viticola through the analysis of gene expression in germinated zoospores. Fungal Biology 116: 825-835

Mestre P, Carrere S, Gouzy J, Piron MC, Tourvieille de Labrouhe D, Vincourt P, Delmotte F, Godiard L (2016) Comparative analysis of CRN and RXLR efffectors from two Plasmopara species causing grapevine and sunflower downy mildew. Plant Pathology 65: 767-781.

Dussert Y, Gouzy J, Richart-Cervera S, Mazet ID, Delière L, Couture C, Legrand L, Piron MC, Mestre P, Delmotte F (2016) Draft genome sequence of Plasmopara viticola, the grapevine downy mildew pathogen. Genome Announcements 4(5):e00987-16

Recherche de résistances a priori durables

Dans le cadre du projet ANR EFFECTOORES, nous avons réséquencé 10 isolats de P. viticola et obtenu des données de RNA-Seq à différents temps après infection. Ces données permettront d’identifier des effecteurs importants pour le pathogène qui seront utilisés pour cribler des ressources génétiques à la recherche de gènes de résistance potentiellement durables.

Mise au point d’une méthode d’expression transitoire de gènes sur feuilles de vigne.

L’identification de gènes Avr de P. viticola passe par la mise au point d’une méthode d’expression transitoire pour l’analyse fonctionnelle de gènes chez la vigne. Une méthode permettant des niveaux acceptables d’expression en utilisant des plantes issues de la culture in vitro infiltrées sous vide a été mise au point. La validité de la méthode a été confirmée par deux études d’analyse fonctionnelle de gènes de vigne menées en collaboration avec des collègues du LVBE de l'Université d'Haute Alsace, Colmar.

Santos-Rosa M, Poutaraud A, Merdinoglu D, Mestre P (2008) Development of a transient expression system in grapevine via agro-infiltration. Plant Cell Reports 27: 1053-1063.

Le Henanf G, Heitz T, Mestre P, Mutterer J, Walter B and Chong J (2009) Characterization of Vitis vinifera NPR1 homologs involved in the regulation of Pathogenesis-Related gene expression. BMC Plant Biology 9: 54.

Chong J, Piron MC, Meyer S, Merdinoglu D, Bertsch C, Mestre P (2014) The SWEET family of sugar transporters in grapevine: VvSWEET4 is involved in the interaction with Botrytis cinerea. Journal of Experimental Botany 65: 6589-6601.

2. Potentiel évolutif du pathogène

Bien connaître l’étendue de la variabilité génétique de P. viticola est un prérequis important pour pouvoir évaluer la durabilité des résistances. Pour mener à bien le programme d’amélioration variétale de la vigne il est nécessaire de comprendre l’organisation de la diversité génétique du pathogène en Europe mais aussi dans l’Amerique du Nord, son bassin d’origine. Pour cela, nous travaillons en étroite collaboration avec l’équipe de François Delmotte de l’UMR SAVE de l’INRA de Bordeaux, qui a développé un programme sur la génétique du mildiou de la vigne dans le but de comprendre le fonctionnement des populations de ce pathogène et d’évaluer ses capacités adaptatives (mode de reproduction, structuration géographique, capacité de migration, adaptation à l’environnement).